En 1526, forma una segunda expedición, mientras Almagro regresa a Panamá para solicitar refuerzos. Tras una angustiosa travesía Pizarro llega a la isla de Gallo y allí, ante una situación incierta y la inquietud de sus hombres, desenvaina su sable y con él traza una línea en la arena, de oriente a occidente y dice a sus parciales: “por aquí, señalando el norte se vuelve a Panamá a seguir siendo pobres colonos, y por acá, señalando al sur, se va al Perú, a ser ricos y famosos. Ahora escoja el castellano lo que mejor le estuviese”. Pizarro cruzó la línea y se puso en el lado sur de la raya que había trazado, trece hombres resueltos a todo le siguieron. Acto que la historia llegó a denominar “Los Trece de la Fama”. Con los que Pizarro emprendió la conquista del Perú.
Sin embargo, la ayuda prometida por Almagro se deja esperar, y en noviembre de 1527, muy a su pesar, Piza-rro retorna Panamá y de ahí se embarca a España en 1528 para recurrir a Carlos I y obtener una orden explícita para la conquista del Perú. El 26 de julio de 1529 firma con el rey las capitulaciones de Toledo, recibiendo los títulos de gobernador, capitán general, adelantado y al-guacil mayor de Nueva castilla (Perú), mientras que a Almagro se le nombra gobernador de Tumbes y a los restantes 13 hombres se les concede la hidalguía. Poco después Pizarro, en nombre y bajo el patrocinio de la corona de Castilla, parte dispuesto a la conquista del gran Imperio Inca.